Solubility as a limiting factor for expression of hepatitis A virus proteins in insect cell-baculovirus system

The use of recombinant proteins may represent an alternative model to inactivated vaccines against hepatitis A virus (HAV). The present study aimed to express the VP1 protein of HAV in baculovirus expression vector system (BEVS). The VP1 was expressed intracellularly with molecular mass of 35 kDa. The VP1 was detected both in the soluble fraction and in the insoluble fraction of the lysate. The extracellular expression of VP1 was also attempted, but the protein remained inside the cell. To verify if hydrophobic characteristics would also be present in the HAV structural polyprotein, the expression of P1-2A protein was evaluated. The P1-2A polyprotein remained insoluble in the cellular extract, even in the early infection stages. These results suggest that HAV structural proteins are prone to form insoluble aggregates. The low solubility represents a drawback for production of large amounts of HAV proteins in BEVS.

Expressão heteróloga de proteínas do vírus da Hepatite A e avaliação da imunogenicidade / Heterologous expression of hepatitis a virus proteins and immunogenicity evaluation

O vírus da hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli. Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (Al(OH)3) e o adjuvante a base de saponina...

The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and haslow yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coliexpression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coli-derived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant...

Expressão da proteína VP6 de rotavírus A em sistemas eucariotos: células de mamífero e células de inseto / Expression of rotavirus VP6 protein in the eukaryotic systems, mammalian cells and insect cells

Os rotavírus A (RV-A) são os principais agentes causadores da gastroenterite infantil, sendo responsáveis por cerca de 600.000 mortes a cada ano no mundo. A proteína VP6 apresenta epítopos conservados entre as diversas estirpes de RV-A, o que a torna o antígeno de eleição para ensaios de diagnóstico. Além disso, a proteína VP6 representa um antígeno em potencial para o desenvolvimento de uma vacina contra RV-A baseada em subunidade viral. O objetivo deste estudo foi expressar a proteína VP6 de RV-A humano nos sistemas eucariotos, células de mamífero e células de inseto. Assim, o gene VP6 de RV-A humano foi subclonado no vetor de expressão pCl-neo, gerando a construção pCl-neo VP6. Essa construção foi utilizada para expressar a proteína VP6 recombinante (VP6r), de forma transitória, em células embrionárias de rim humano transformadas com o antígeno T do vírus símio 40 (HEK293-T). A VP6r manteve a capacidade de oligomerizar-se em trímeros e sua distribuição sugeriu a formação de estruturas semelhantes a túbulos. A cromatografia de imunoafinidade foi utilizada para purificar a VP6r a partir dos extratos de células HEK293-T. Entretanto, acredita-se que o baixo nível de expressão impossibilitou a purificação da VP6r. Alternativamente, optou-se por transfectar células de ovário de hamster chinês deficientes do gene da diidrofolato redutase (CHO Dhfr negativo) e obter clones estáveis expressando a VP6r. Assim, o gene VP6 foi subclonado no vetor de expressão pMBM, gerando a construção pMBMVP6. Células CHO Dhfr negativo foram transfectadas com a construção pMBMVP6 e clones celulares resistentes ao mesmo de seleção foram isolados...